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細胞轉染是一種廣泛使用的實驗室技術，通過將外源核酸（如DNA、mRNA、siRNA等）導入到受體細胞中，在基因功能研究、疾病模型構建、蛋白表達及藥物開發等領域發揮著關鍵作用。然而，由于不同來源的細胞具有不同的生理特性，它們對轉染條件的敏感性存在顯著差異，導致轉染效率參差不齊。因此，如何有效提升這一效率已成為科研工作者面臨的重要挑戰。
本期細胞學堂將分享四個關鍵優化步驟，助您輕松提高轉染效率！
選擇適合的轉染方法
常見的細胞轉染方法包括化學法、物理法和病毒載體法[1]。
化學法
化學法包括脂質體轉染法、DEAE-葡聚糖法、陽離子聚合物轉染法等。其原理是利用轉染試劑（如陽離子脂質體、DEAE-葡聚糖、陽離子聚合物等）與帶負電荷的核酸形成復合物，并通過內吞作用進入細胞，從而實現細胞轉染。化學轉染法具有操作簡便、適用范圍廣等優點，但也存在一定的細胞毒性[2-4]。因此，針對不同的細胞類型，選擇適合的轉染試劑對轉染效果具有決定性影響。
物理法
物理法包括顯微注射法、電穿孔法等[5]。其中，電穿孔方法是利用高壓電流脈沖在細胞膜上形成瞬時微孔，使核酸等生物分子進入細胞。該方法轉染效率高，但對細胞的損傷較大，細胞致死率高。
病毒載體法
病毒載體法，如慢病毒、腺病毒和逆轉錄病毒。尤其是，慢病毒和逆轉錄病毒可以將基因組整合到宿主細胞中，實現穩定且長期的基因表達[6]。然而，病毒載體法存在細胞毒性和潛在的生物安全風險，需要嚴格的操作規范。
根據細胞類型和實驗目的選擇合適的轉染方法至關重要。對于大多數貼壁細胞，脂質體轉染是一種常用且較為溫和的方法；而對于原代細胞或難轉染的懸浮細胞，電穿孔或病毒載體轉染可能更為合適。
優化細胞密度
細胞密度是影響轉染效率的重要因素之一。
一般來說，貼壁細胞在70%-90%匯合度時轉染效果較好。然而，對于某些特殊的細胞系或轉染方法，可能需要調整細胞密度。建議在轉染前一天設置多個細胞密度梯度進行接種，以便在轉染細胞時達到不同的匯合度。轉染后，通過實驗評估各組的轉染效率和細胞狀態，以確定最佳的細胞密度范圍。
優化待轉物濃度與轉染試劑比例
以脂質體轉染為例，脂質體轉染試劑和待轉物的比例不同，對轉染效率和細胞毒性有顯著影響。
為了優化轉染效果，建議在細胞消化接種到孔板時，每孔加入等量的細胞懸液，以確保轉染時細胞密度的一致性。根據轉染試劑說明書推薦比例，設置梯度，如轉染試劑：待轉物比例分別為1:1、2:1、3:1，制備不同濃度的轉染復合物，分別加入到相應的孔中，每個比例設置3個重復孔以確保數據的可靠性。將培養板置于細胞培養箱中孵育一定時間后，通過熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測轉染效率，并用CCK-8法檢測細胞存活率。根據實驗結果，選擇轉染效率高且細胞毒性低的最佳比例，用于后續實驗。
優化孵育時間
轉染后細胞與轉染復合物的孵育時間是影響轉染效果的重要因素之一。
孵育時間過短可能導致轉染復合物未能充分進入細胞，導致轉染效率低；而孵育時間過長則可能增加轉染試劑對細胞的毒性，影響細胞狀態。為了優化轉染效果，建議在轉染后設置多個時間點（如6 h、12 h、24 h等）更換培養基，并觀察轉染效率和細胞毒性變化。對于一些對轉染試劑較為敏感的細胞，縮短孵育時間可能有助于降低細胞損傷，同時保持較高的轉染效率。通過實驗確定最佳孵育時間，以實現轉染效果和細胞活性的平衡。在完成一系列優化實驗后，需對結果進行系統總結。對比不同條件下轉染效率和細胞存活率的數據，分析各參數對轉染效果的影響。根據實驗結果，總結出適用于特定細胞系或實驗體系的轉染條件優化策略，為后續實驗提供參考依據。
案例分享：
Hep G2細胞轉染條件優化
實驗目標
為了確定人肝癌細胞Hep G2的最佳轉染條件，本研究將綠色熒光蛋白基因（EGFP）通過不同轉染條件導入Hep G2，并觀察其表達情況。
預實驗
在預實驗階段，我們選擇了一種常規的轉染試劑，嚴格按照說明書操作。但轉染效率非常低，不到10%的細胞表達了熒光蛋白。
優化策略
為了提高轉染效率，我們從以下幾個方面進行了優化。
細胞培養條件：選擇適合HepG2細胞生長的培養基。
轉染試劑篩選：測試多款轉染試劑，選擇其中一種轉染效果最-佳的，進一步優化其轉染方案。
質粒的質量和濃度：使用高質量的質粒提取試劑盒和試劑，確保質粒的純度和完整性。通過濃度梯度的實驗，測試了轉染試劑（μL）與質粒（μg）的不同比例（1:1，2:1，3:1，4:1，5:1），觀察不同比例下轉染Hep G2細胞的綠色熒光蛋白（EGFP）表達效果。實驗結果顯示，最佳的轉染試劑與質粒比例為2:1（如圖1）。
轉染復合物孵育時間和孵育溫度：設置了不同的孵育時間和溫度梯度，觀察其對轉染效率的影響。實驗發現轉染復合物在室溫（20-25℃）孵育20 min時，轉染效果最-優。
實驗結果
經過一系列的優化實驗，Hep G2轉染效率顯著提高。60%以上細胞表達了熒光蛋白，實現了熒光蛋白基因在Hep G2細胞中的高效表達（如圖2）。
圖1. 轉染試劑與質粒不同比例下Hep G2細胞的熒光蛋白表達效果
圖2. 用EGFP表達質粒轉染Hep G2細胞48 小時后的熒光蛋白表達效果（A：白光圖，B：熒光圖，C：流式檢測轉染效率）
細胞轉染注意事項
細胞狀態
細胞狀態是影響轉染效率的關鍵因素之一。應確保使用處于對數生長期且活力良好的細胞，避免使用傳代次數過多或受污染的細胞。
核酸的質量和純度
核酸的質量和純度對轉染效果至關重要，應使用無內毒素的高純度核酸。
實驗設計
在優化轉染條件時，建議設置空載體對照、未轉染組及陽性對照組，以排除干擾因素，確保實驗結果的可靠性。
細胞類型和轉染條件
不同細胞類型對轉染方法和條件的要求不同，需根據具體細胞類型和實驗目的進行調整。
希望這篇關于細胞轉染條件優化的詳細解析能幫助您提升細胞轉染效率！更多細胞培養相關干貨，請持續關注細胞學堂專欄~
參考文獻
[1]
Fus-Kujawa A, Prus P, Bajdak-Rusinek K, Teper P, Gawron K, Kowalczuk A, Sieron AL. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2021 Jul 20; 9: 701031.
[2]
Zhi D, Bai Y, Yang J, Cui S, Zhao Y, Chen H, Zhang S. A review on cationic lipids with different linkers for gene delivery. Advances in Colloid and Interface Science. 2018 Mar; 253: 117-140.
[3]
Paecharoenchai O, Niyomtham N, Apirakaramwong A, Ngawhirunpat T, Rojanarata T, Yingyongnarongkul BE, Opanasopit P. Structure relationship of cationic lipids on gene transfection mediated by cationic liposomes. AAPS PharmSciTech. 2012 Dec; 13 (4): 1302-8.
[4]
Huang QD, Ren J, Ou WJ, Fu Y, Cai MQ, Zhang J, Zhu W, Yu XQ. Cationic lipids containing cyclen and ammonium moieties as gene delivery vectors.Chemical Biology & Drug Design. 2012 Jun; 79 (6): 879-87.
[5]
O'Brien JA, Lummis SC. Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles. BMC Biotechnology. 2011 Jun 10; 11: 66.
[6]
G?decke N, Hauser H, Wirth D. Stable expression by lentiviral transduction of cells. Methods in Molecular Biology. 2024; 2810: 147-159.
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