小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一般采用長骨解剖和骨髓分離的程序。總體目標(biāo)是快速、系統(tǒng)地取出長骨,收集骨髓細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析。該方法有助于回答有關(guān)骨髓生物學(xué)、腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫學(xué)的關(guān)鍵問題。這種技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是解剖過程快速且標(biāo)準(zhǔn)化,骨髓分離過程相當(dāng)無菌。首先,將小鼠殺死并置于仰臥位。
然后將小鼠的四個(gè)爪墊固定在踝關(guān)節(jié)下方,用70%乙醇噴灑小鼠并*清洗腿部。接下來,在臀部正上方的下腹部中線右側(cè)做一個(gè)小切口,將切口向下延伸至腿部并穿過腳踝,拉回皮膚。
然后將固定在股骨近端的股四頭肌切開,露出腿骨前部,用銷釘將腿上的肌肉與板成45度角固定。將剪刀壓在股骨后部,從膝關(guān)節(jié)剪下腘繩肌。然后將固定在股骨近端的皮膚和腘繩肌向后拉,露出骨后部,用固定銷45度角從腿上固定腘繩肌。
用鑷子抓住股骨遠(yuǎn)端,就在膝關(guān)節(jié)上方。然后將股骨干兩側(cè)的剪刀刀片導(dǎo)向髖關(guān)節(jié)。到達(dá)股骨頭后,扭動剪刀,將頂部刀片直接移動到股骨頭上方,使股骨脫臼。
用鑷子抓住股骨干的頂部,從股骨頭上切下軟組織,將股骨從髖臼中取出。然后將包括股骨、膝蓋和脛骨在內(nèi)的整個(gè)腿骨從身體上拉出來,小心地切斷連接腿和皮膚的結(jié)締組織和肌肉。腳踝的結(jié)締組織被剪刀扭曲脫位后。
抓住脛骨遠(yuǎn)端,注意不要割傷肌腱,將脛骨向上拉離身體和指甲板。然后去除膝蓋長骨上殘留的任何結(jié)締組織以及附著在股骨和脛骨上的任何肌肉或結(jié)締組織。抓住股骨,髕骨朝外,股骨頭朝下。
過度拉伸膝蓋并扭轉(zhuǎn)剪刀以使脛骨和股骨脫臼。然后去除連接股骨和脛骨的所有結(jié)締組織。接下來,握住股骨,正面朝外,股骨頭向下,然后將剪刀沿股骨干向上引導(dǎo)至髁。
輕輕地來回轉(zhuǎn)動剪刀,去除髁突、髕骨和骨骺,露出干骺端。然后,用鑷子、剪刀和低塵擦拭紙去除附著在股骨上的任何肌肉或結(jié)締組織。接下來,抓住脛骨,正面朝外,腳踝端朝下。
如果脛骨骨骺完好,將剪刀沿脛骨軸向上引至髁突,輕輕來回轉(zhuǎn)動剪刀,將髁突和骨骺取出,露出脛骨干骨骺。然后移除附著在脛骨上的任何肌肉或結(jié)締組織,如圖所示。要獲得骨髓,首先將一根18號針頭穿過0.5ml微量離心管的底部。
然后將長骨放入管中,膝蓋向下,蓋住。將0.5ml微量離心管放入1.5ml微量離心管中,在大于等于10000倍g的微量離心管中離心15秒。目視檢查證實(shí)骨髓已從骨頭中分離出來小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。